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        行業新聞

        PCR檢測的常見問題及解決辦法

              聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷;可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。


        首先,我們要明確PCR反應的關鍵環節有:

        ①模板核酸的制備;

        ②引物的質量與特異性;

        ③酶的質量與特異性;

        ④PCR循環條件。

        而尋找問題的原因亦應針對上述環節進行分析研究。

        注PCR產物的電泳檢測時間,一般為48h以內,有些最好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚至消失。


        假陰性,不出現擴增條帶,正對照有條帶,樣品無條帶?


        可能原因及解決方法:
        1.模板:①模板中含有雜蛋白質;
                      ②模板中含有Taq酶抑制劑;
                      ③模板中蛋白質沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白;
                      ④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚;
                      ⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。

        2.引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增。

        3.酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

        4.Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

        5.反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul,或100ul,應用多大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

        6.物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

        7.靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

        解決辦法:
        1.純化模板并重新提取,并檢測模板是否含有抑制劑;

        2.引物:①選定一個好的引物合成單位;
                     ②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。
                   ③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。
                  ④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等;

        3.優化 buffer,摸索鎂離子濃度或適當加入 DMSO(小于 0.3%);

        4.提高退火溫度,增加延伸時間。



        假陽性,空白對照出現條帶?


        可能原因及解決辦法:
        1.引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。

        2.靶序列或擴增產物的交叉污染,這種污染有兩種原因:
        ①整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決,操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。

        ②空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。
        解決方法:
        1.實驗儀器高壓滅菌;
        2.實驗試劑(酶除外)高壓滅菌,離心管槍頭一次性使用;
        3.規范實驗操作;
        4.假陽性可通過巢式 PCR 解決,或者使用特異性較高的試劑盒擴增。


        出現非特異性擴增帶,PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶?


        可能原因及解決辦法:

        1.引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。

        2.Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多有關。

        3.酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

        解決方法:

        1.必要時重新設計引物;

        2.減低酶量或調換另一來源的酶;

        3.降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數;

        4.適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。


        拖尾、彌散,PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶?


        可能原因及解決辦法:

        1.酶量過多或酶的質量差;

        2.dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高;

        3.退火溫度過低,循環次數過多。

        解決方法:

        1.減少用酶量或使用特異性高的熱啟動酶擴增;

        2.減少dNTP的濃度,適當降低Mg2+濃度;

        3.增加模板量,減少循環次數。


        cDNA產量的很低?


        可能的原因及解決辦法:

        1.RNA模板質量低;

        2.對mRNA濃度估計過高;

        3.反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足;

        4.同位素磷32過期;

        5.反應體積過大,不應超過50μl。


        產生彌散(smear)條帶?


        可能的原因及解決辦法:

        1.在PCR反應體系中第一鏈產物的含量過高;

        2.減少引物的用量;

        3.優化PCR反應條件/減少PCR的循環次數;

        4.在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時,其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增,一般會顯示為彌散背景。


        產生大分子量的彌散條帶?


        可能的原因及解決辦法:

        1.大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的;

        2.對于長片段的PCR,建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)。


        在無反轉錄酶的情況下,對照RNA獲得擴增結果?


        可能的原因及解決辦法:

        1.通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響;

        2.有可能是引物二聚體的條帶。


        擴增產物滯留在加樣孔中?


        可能的原因及解決辦法:

        1.有可能是由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物,建議將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增;

        2.另外,在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃,可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。


        為什么得不到RACE產物?


        可能的原因及解決辦法:

        1.加入Hela對照;

        2.低質量的RNA模板;

        3.逆轉錄失敗,SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成;

        4.目的基因豐度太低,可以通過提高PCR的循環次數來解決,建議使用巢式PCR;

        5.目的基因沒有表達,可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因;

        6.目的基因太長而不適合進行反轉錄,建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA,使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR;

        7.cDNA模板屬于困難模板,可以通過以下方法解決:優化PCR反應參數及反應體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區;使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應。

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